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盘点全基因组CRISPR检测的几大关键技术【亚博取款心丈秒到账】

时间:2021-11-13 00:33:04 作者:亚博取款心丈秒到账 点击:

本文摘要:在2013年,来自麻省总医院的研究人员找到用于CRISPR-CasRNA引导性核酸酶的一个最重要局限:不会在预期靶点以外的位点上分解多余的DNA变异。

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在2013年,来自麻省总医院的研究人员找到用于CRISPR-CasRNA引导性核酸酶的一个最重要局限:不会在预期靶点以外的位点上分解多余的DNA变异。此后相继有研究必要说明了CRISPR/Cas9不存在相当严重的脱靶性,即该技术可以再次发生非特异性切割成,引发基因组非靶向位点的变异,这样不会导致研究结果的不确定性以及研究工作的大量减少,这一问题相当严重地容许了Cas9的应用于。因此科学家们期望能通过仅有基因组检测脱靶剪切,近年来研发了不少检测脱靶剪切酶活性的实验方法,比如近期NatureMethods报导的两项技术,这些技术是什么,具备何种优势,明确让我们来想到:GUIDE-seq以往人们在检测CRISPR-Cas核酸酶诱导的脱靶DNA脱落时,往往事前假设脱靶位点与靶标位点相近。GUIDE-seq是首个不必须这样做到的方法,而且它非常灵敏。

一组研究人员利用一种较短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas诱导的脱靶脱落,测序这些标签所在的基因组区域,就需要确认脱靶变异的方位。研究指出,就算某个脱靶变异的经常出现频率较低至0.1%,GUIDE-seq也需要检测获得。由于许多脱靶变异再次发生在与目标位点差异相当大的地方,因此脱靶DSB的数量和方位是很难预测的。

现有工具主要是通过分析目标序列来预测脱靶变异,研究人员将这些工具与GUIDE-seq展开了较为。研究表明,上述工具在预测已检验的脱靶位点时比GUIDE-seq差很多,还不会错误检测实质上不被酶托的位点。此外,研究人员还对比了GUIDE-seq和ChIP-seq(检测蛋白与DNA的融合),结果证明ChIP-seq并不是检验CRISPR-Cas脱靶DSB的可信方法。

Digenome-seq来自韩国釜山大学、釜山基础科学研究所等机构的研究人员在Nature旗下子刊《NatureMethods》公开发表一项研究,顺利证实CRISPR-Cas9在人类细胞中有准确的射击训练起到,他们研发出有一种强劲、脆弱、无偏见和具备成本效益的方法——Digenome-seq,可在全基因组范围内检测人类细胞中的CRISPR/Cas9脱靶效应。在这项研究中,研究人员称之为,虽然RNA引领的、通过CRISPR-Cas9系统的基因组编辑早已被普遍应用于生物医学研究,但是Cas9核酸酶的全基因组靶向特异性依然是有争议的。为此,他们明确提出一种方法Digenome-seq,利用基因组测序查询CRISPR-Cas9有可能变异产生的射击训练和脱靶序列。他们用Cas9核酸酶在试管中消化人类基因组DNA,然后展开仅有基因组测序。

这种体外消化可产生射击训练和脱靶序列的独有模式,可以通过计算出来确认。此外,个在sgRNA末端加到构成CRISPR-Cas9的鸟嘌呤核苷酸,研究人员顺利地制取了这种高度发达的可编程核酸酶,在人类基因组中它没可测量的脱靶效应。

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此后,这一研究组又发布了Digenome-seqUltra,并且他们用这一技术同时分析了11个CRISPR-Cas9核酸酶在整个基因组中的特异性,大大节省了CRISPR脱靶分析所需的时间和经费。研究人员再行将基因组DNA从人类细胞中萃取出来,然后用多个sgRNA-Cas9人组展开消化,最后展开仅有基因组测序。

他们用一种新的DNA剪切评分系统,检验了Cas9在基因组中的剪切模式,即射击训练和脱靶位点的特性。研究指出,mRNA自双链寡核苷酸的sgRNA引发了许多脱靶事件,而mRNA自质粒模板的sgRNA没这样的问题。多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脱靶位点。

研究人员还在此基础上得出了增加CRISPR-Cas9脱靶效应的指南。


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